Southern Blot

Das Southern-Blot-Verfahren wurde im Jahr 1975 von Edwin Southern entwickelt. Die verwandten Untersuchungsmethoden des Northern Blot (Analogverfahren zur RNA-Analyse) und des Western Blot (Proteinanalyse) wurden erst später entwickelt und in Anlehnung an Southerns Namen nach Himmelsrichtungen benannt.

Vor der Entwicklung der PCR war es bereits möglich, mittels Southern Blot Rückschlüsse auf das Vorhandensein von Mutationen zu ziehen. Das Verfahren eignete sich für den Nachweis von Punktmutationen bis hin zur Analyse von Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLP). Das sehr aufwendige Verfahren ist heute weitgehend durch PCR-basierte Analysen abgelöst und wird i.d.R. nur noch zur Untersuchung von RFLPs eingesetzt.^[1]

Das Southern-Blot-Verfahren erlaubt den Nachweis von bestimmten Gensequenzen durch das gezielte Fragmentieren der DNA mithilfe von Restriktionsenzymen und die anschließende Analyse durch das Einsetzen von Sonden. Dafür sind folgende Schritte notwendig:^[1]

• Behandlung der isolierten genomischen DNA mit Restriktionsenzymen, welche die DNA an entsprechenden Restriktionsschnittstellen schneiden und dadurch fragmentieren
• gelelektrophoretische Auftrennung der einzelnen DNA-Fragmente nach ihrer Größe
• Spaltung der Doppelstränge in Einzelstränge durch den Einsatz von schwachen Laugen oder Denaturierungslösungen
• Blotting: Übertragung der durch die Gelelektrophorese hervorgebrachten DNA-Banden auf eine Nitrocellulose-, Nylonmembran. Für den Transfer stehen drei verschiedene Methoden zur Verfügung:
  • Kapillar-Blot: nutzt die Kapillarkraft, um die DNA mithilfe einer Pufferlösung aus dem Gel auf die Membran zu transportieren.
  • Vakuum-Blot: Die Methode funktioniert prinzipiell wie der Kapillar-Blot. Der Transfer wird allerdings durch einen Unterdruck ermöglicht.
  • Elektro-Blot: Die DNA-Banden werden durch das Anlegen einer elektrischen Spannung übertragen. Die negativ geladene DNA wandert in einer Elektrolytlösung aus dem Gel in Richtung der hinter der Membran gelegenen Anode.
• Fixierung der gebundenen DNA auf der Membran mittels UV-Licht
• Inkubation der Membran mit einer radioaktiv, chemisch oder fluoreszierend markierten, der gesuchten DNA-Sequenz komplementären, einzelsträngigen DNA oder RNA (= Sonde). Es entstehen Basenpaarungen der Sonde mit der gesuchten DNA-Sequenz
• Auswaschen nicht oder unspezifisch gebundener Sonden
• Analyse des durch die Sonden darstellbaren Bandenmusters auf der Blotmembran, je nach Sonde mittels Röntgenfilm, Indikatorsubstanz oder Fluoreszenz

Das erhaltene Bandenmuster ist im Wesentlichen abhängig von der Länge der DNA-Fragmente, die durch das Schneiden der Restriktionsenzyme produziert werden. Die Fragmentlänge kann beispielsweise durch eine DNA-Sequenzveränderung (z.B. durch eine Punktmutation oder Repeatexpansionen) verlängert werden.

Eine Erweiterung des Southern-Blot-Verfahrens erlaubt zusätzlich eine Untersuchung des Methylierungsstatus in der Zielsequenz. Dabei werden die DNA-Fragmente verglichen, die mithilfe von methylierungsabhängigen und -unabhängigen Restriktionsenzymen entstehen.^[2][3]

Der Southern Blot wird zur Analyse von Repeatexpansionen, z.B. bei myotoner Dystrophie oder Fragilem-X-Syndrom eingesetzt. Ein Vorteil ist, dass betroffene DNA-Fragmente mit einer großen Wiederholungszahl untersucht werden können, was bisher (2024) weder mittels Sequenzierung noch per DNA-Array möglich ist.^[1][2]